瀏覽數(shù)量： 0 作者： 本站編輯 發(fā)布時間： 2024-06-11 來源： 本站
質(zhì)粒提取是分子生物學實驗中常用的技術之一，盡管操作簡單，但其背后的原理很多人并不完全了解。市面上常用的質(zhì)粒提取試劑盒，通常通過加入不同的溶液（如溶液1、2、3），經(jīng)過洗滌和洗脫步驟來提取純凈的質(zhì)粒DNA。然而，每種溶液的成分及其在實驗中所起的具體作用，仍然是許多人不熟悉的。
質(zhì)粒提取實驗原理
Principle
在細胞中，存在多種生物大分子，包括蛋白質(zhì)、基因組DNA、質(zhì)粒DNA和RNA。質(zhì)粒提取的目標是從這些復雜的分子混合物中分離出純凈的質(zhì)粒DNA，而避免其他大分子的干擾。為實現(xiàn)這一目標，需采用特定的方法分別處理這些不同的分子。
基因組DNA與質(zhì)粒
Distinguish
細菌沒有細胞核，只有一個擬核，DNA是環(huán)狀的，但是并非裸露的，上面結(jié)合有多種核蛋白（NAPs）。NAPs和基因轉(zhuǎn)錄活性可以改變擬核的形態(tài)結(jié)構(gòu)，相對而言，質(zhì)粒DNA較為簡單，以共價閉環(huán)（cccDNA）形式游離于細胞質(zhì)中。
常用質(zhì)粒提取方法
Method
目前常用的質(zhì)粒提取方法包括堿裂解法、煮沸法和去污劑裂解法。前兩種方法較為劇烈，適用于較小的質(zhì)粒（<15Kb），而去污劑裂解法較為溫和，適用于較大分子量的質(zhì)粒（>15Kb）。
堿裂解法
堿裂解法是較為廣泛的質(zhì)粒DNA提取方法，基于共價閉合環(huán)狀DNA與線性DNA的拓撲結(jié)構(gòu)差異進行分離。其步驟如下：
1）堿裂解與細胞破裂
在強堿性環(huán)境（pH 12.0-12.6）下，細菌的細胞壁和細胞膜被十二烷基硫酸鈉（SDS）破壞，基因組DNA和質(zhì)粒DNA被釋放。
染色體及線性DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)在高堿性條件下發(fā)生變性，而質(zhì)粒DNA由于結(jié)構(gòu)緊密，不易變性。
2） 中和與復性
將溶液的pH調(diào)至中性，共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA能夠快速復性，恢復其天然結(jié)構(gòu)。
線性基因組DNA復性緩慢，與蛋白質(zhì)及細胞碎片纏繞形成不溶性復合物，沉淀下來。
3）沉淀與分離
在高鹽條件下（例如，使用鉀離子代替鈉離子），細胞碎片、變性蛋白質(zhì)和線性基因組DNA沉淀，質(zhì)粒DNA則保持可溶狀態(tài)。
經(jīng)過離心，去除沉淀物，上清液中的質(zhì)粒DNA可通過乙醇沉淀或硅膠膜特異性吸附等方法進一步純化。
主要試劑成分及作用
Composition and Function
在沒有質(zhì)粒提取試劑盒之前，大多提取質(zhì)粒都是自己配置試劑來提取大腸桿菌中的質(zhì)粒，主要用到以下三個試劑：
溶菌液
葡萄糖：增加溶液粘度，維持滲透壓，防止DNA因機械剪切力作用而降解。
EDTA：螯合Mg?2;?、Ca?2;?等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶（DNase）對DNA的降解作用，同時有助于溶菌酶的作用。
NaOH-SDS液
NaOH：核酸在pH＞5，＜9的溶液中穩(wěn)定，但在pH＞12或＜3時會引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。
SDS：SDS是離子型表面活性劑，主要功能有：1、溶解細胞膜上的脂質(zhì)和蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜；2、解聚細胞中的核蛋白；3、SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-SO3-....R+-蛋白質(zhì)的復合物，使得蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。
3mol/L NaAc（pH4.8）溶液
該溶液為NaAc-HAc緩沖液，調(diào)節(jié)抽提液pH至中性，使變性的質(zhì)粒DNA能夠復性并穩(wěn)定存在。
高鹽的3mol/L的NaAc有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白質(zhì)復合物凝聚而沉淀之。
