瀏覽數(shù)量： 0 作者： 本站編輯 發(fā)布時(shí)間： 2024-06-03 來(lái)源： 本站
微生物分離與純化是從混合菌群中獲取單一菌株的關(guān)鍵過程。本文以分離土壤中放線菌、真菌、細(xì)菌為例，介紹了平板分離法在微生物分離與純化中的廣泛應(yīng)用。由于其簡(jiǎn)便性和高效性，平板分離法能夠通過不同的分離技術(shù)和合適的培養(yǎng)基，有效獲得純菌株，確保后續(xù)研究和應(yīng)用的準(zhǔn)確性。
1、稀釋涂布平板法
稀釋涂布平板法是一種通過梯度稀釋菌液，并將其涂布在固體培養(yǎng)基表面，最終形成單個(gè)菌落的方法。其原理在于，在稀釋度足夠高的菌液中，聚集在一起的微生物將被分散成單個(gè)細(xì)胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個(gè)菌落。
具體步驟如下：
1）倒平板
將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏1號(hào)培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基溶解并冷卻至55~60℃，分別加入特定的添加劑并混勻后倒入培養(yǎng)皿，每種培養(yǎng)基倒3皿（重復(fù)）。
2）制備土壤稀釋液
a、 稱取土壤：稱取10g鮮土，放入含有90ml無(wú)菌水和玻璃珠的錐形瓶中。
b、混合土壤：在150r/min的搖床上震蕩30分鐘，使土壤與水充分混合，菌體完全分散。
c、逐級(jí)稀釋：
吸取1ml土壤懸液注入第一支含有9ml無(wú)菌水的試管中，震蕩混勻。
從第一支試管中吸取1ml懸液，注入第二支含有9ml無(wú)菌水的試管中，震蕩混勻。
重復(fù)此過程，依次制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7稀釋度的土壤溶液，待用。
3）涂布
a、制備平板：將滅菌的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，待平板冷卻后使用。
b、涂布過程：將10-2和10-3稀釋度的土壤菌懸液涂布在平板上進(jìn)行放線菌的形態(tài)觀察培養(yǎng)；將10-4和10-5稀釋度的土壤菌懸液涂布在平板上進(jìn)行真菌形態(tài)的觀察培養(yǎng)；將10-6和10-7稀釋度的土壤菌懸液涂布在平板上進(jìn)行細(xì)菌的形態(tài)觀察培養(yǎng)。
c、涂布技巧：先從下向上推開，再左右推開，后在培養(yǎng)基上半部分充分推開，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)基，將下半部分轉(zhuǎn)至上方，重復(fù)上述推開操作。在轉(zhuǎn)動(dòng)過程中，涂布器不可伸出培養(yǎng)皿外，最后由中間向外轉(zhuǎn)圈涂布，再由外向內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)圈涂布均勻。
4）培養(yǎng)
倒置于30℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，細(xì)菌培養(yǎng)48小時(shí)，真菌和放線菌培養(yǎng)168小時(shí)。
5）純化
挑取單菌落進(jìn)行分離純化3～4次，得到細(xì)菌純種。
2、平板劃線法
平板劃線法是一種通過在平板表面劃線稀釋樣品以獲得單菌落的方法。其原理在于，每次劃線都會(huì)導(dǎo)致接種環(huán)上的菌體分布更為疏松，最終實(shí)現(xiàn)單菌落的分離。
具體步驟如下：
1）劃線區(qū)劃分
將一個(gè)平板分為A、B、C、D四個(gè)區(qū)域，面積由小到大排列。
2）劃線過程
使用接種環(huán)在每個(gè)區(qū)域劃線，逐步稀釋菌體，A 區(qū)為待分離的菌源區(qū)，B和C區(qū)為初步劃線稀釋的過渡區(qū)，D區(qū)（面積最大）則為關(guān)鍵的單菌落收獲區(qū)。
3）培養(yǎng)
培養(yǎng)后觀察D區(qū)單菌落，并進(jìn)行分離純化。
培養(yǎng)基選擇
培養(yǎng)基類型選擇：根據(jù)微生物種類和生長(zhǎng)需求選擇合適的培養(yǎng)基類型，如固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基。
營(yíng)養(yǎng)成分：根據(jù)微生物的生長(zhǎng)需求選擇合適的碳源、氮源、礦物質(zhì)和維生素等營(yíng)養(yǎng)成分。
酸堿度調(diào)整：調(diào)整培養(yǎng)基的酸堿度以適應(yīng)微生物生長(zhǎng)。
培養(yǎng)條件：根據(jù)微生物需求調(diào)整溫度、濕度和光照等培養(yǎng)條件。
常見問題
Q1：為什么在平板劃線中，每次劃線前都要灼燒接種環(huán)？
A1：每次劃線前灼燒接種環(huán)以殺死殘留菌種，確保下次劃線的菌種純度。
Q2：用平板劃線法分離菌種，怎樣保證得到相互分離的菌落？
A2：劃線時(shí)估計(jì)樣本中菌的數(shù)量，調(diào)整兩區(qū)間的重疊線數(shù)。第一區(qū)一般很少能出來(lái)單個(gè)菌落，因此占平板面積不要太大，大面積留給后幾區(qū)。
Q3：如何確定平板上的單菌落是否為純培養(yǎng)？
A3：將單個(gè)菌落再次劃線或稀釋分離，如形成的單菌落形態(tài)單一，即為純種菌落。
Q4：培養(yǎng)基接種后為何要倒置培養(yǎng)？
A4：①防止冷凝水滴落污染培養(yǎng)基；②防止培養(yǎng)基水分蒸發(fā)；③某種程度上防止菌落蔓延。
Q5：無(wú)菌操作的要點(diǎn)是什么？
A5：①保持試管口、瓶口或培養(yǎng)皿開縫處靠近酒精燈火焰區(qū)（保持無(wú)菌環(huán)境）；②試管口不向上，減少污染；③及時(shí)清除接種遺留物品，防止污染；④不同菌種接種時(shí)做好標(biāo)記，避免混雜。
